GMP指南/药典 II 关于微生物鉴定
中国GMP无菌附录（征求意见稿）
第一百一十条 A级或B级洁净区检测到的微生物应当鉴定到种，并应当评估微生物对产品质量（涉及的所有批次）和总体控制状态的潜在影响。
以下情形需考虑对C级和D级洁净区检测到的微生物进行鉴定：
（一）微生物监测结果超过警戒限度或纠偏限度。
（二）分离出可能导致失控、洁净度恶化的微生物。
（三）分离出难以控制的微生物（如形成孢子的微生物、霉菌）。
上述区域微生物鉴定频次应当合理，以保证充分掌握洁净区典型微生物情况。
1、微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程。
2、本指导原则为药物原料、辅料、制药用水、中间产品、终产品、环境、包装材料和容器等检出微生物的鉴定提供指导。当鉴定结果有争议时，以现行版《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）的鉴定结果为准。---药典9204 微生物鉴定指导原则
3、微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，对所检出微生物的常规特征包括菌落形态学、细胞形态学（杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等）、革兰染色或其他染色特性，及某些能够给出鉴定结论的关键生化反应（如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应）进行分析，一般即可满足需要；非无菌产品的控制菌检查一般应达到药典规定的水平；无菌试验结果阳性、无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败、环境严重异常事件时，对检出的微生物鉴定至少达到种水平，必要时需达到菌株水平。
4、微生物鉴定程序
待检菌的分离纯化——获取待检菌的纯培养物（单个菌落）
初筛试验——形态观察、染色镜检（或氢氧化钾拉丝试验）、重要的生化反应等，可为评估提供有价值的信息
表型微生物鉴定——以微生物细胞的形态和习性表型为主要指标，通过比较微生物的菌落形态、理化特征和特征化学成分与典型微生物的差异进行鉴别
微生物分类中常用的表型特征
分类 | 特征 |
培养物 | 菌落形态(如菌落颜色、形状、大小等)、产色素 |
形态学 | 细胞形态(细胞大小、细胞形状、鞭毛类型等)、内容物、革兰染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式 |
生理学 | 氧气耐受性、pH值范围、最适温度和范围、耐盐性 |
生化反应 | 碳源的利用、碳水化合物的氧化或发酵、酶的模式 |
抑制性 | 胆盐耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性 |
血清学 | 凝集反应、荧光抗体 |
化学分类 | 脂肪酸构成、微生物毒素、全细胞组分 |
生态学 | 微生物来源 |
在表型鉴定时应注意采用的培养基、培养时间和传代次数对鉴定结果的影响。目前已有的基于化学分类的鉴定方法，如气相色谱法分析微生物的脂肪酸特征、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF）主要分析微生物的特征蛋白等微生物鉴定系统。
基因型微生物鉴定——无菌检查试验结果阳性、非无菌药品控制菌检查中疑似菌的鉴定、环境监控异常、偏差调查、培养基模拟灌装失败
与表型特征不同，微生物基因型通常不受生长培养基或分离物活性的影响，只需分离到纯菌落便可用于分析。由于大部分微生物物种核酸序列是高度保守的，所以聚合酶链式反应（PCR），DNA探针、DNA-DNA杂交，多位点序列分型、核糖体分型分析，16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA）核酸测序、18S核糖体RNA（18S ribosomal RNA）核酸测序、内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）核酸测序和全基因组核酸测序等基因型鉴定方法理论上更值得信赖。
目前比较常见的鉴定方法为16SrRNA基因测序，即经过聚合酶链式反应PCR进行基因扩增、电泳分离扩增产物，以双脱氧链终止法进行碱基测序，然后与经过验证的专用数据库或利用公共数据库进行序列比对分析。
5、溯源分析
对产品失败相关的微生物进行鉴定是实验室调查及之后生产调查中的关键步骤知道微生物来源可能有助于确定微生物污染产品的途径。溯源分析是通过对污染微生物和相关环节监控微生物进行比对，以同源性的差异程度为依据，确认污染来源的过程。
同一地点的同种菌，其表型特征和基因型特征是基本一致的。不同地点的同种菌，表型特征可能基本一致，但保守及可变区域的基内特征会有一定的差异性。因此，污染调查等应以基因型特征鉴定为主，表型特征鉴定为辅。为了确证微生物为同种中的两个相同株，需比对更多的基因序列和特征基因片段，甚至是全基因组序列的比对，实现既鉴定又溯源的目的，同时保证结果的准确性。
建议采用多项鉴别方法对微生物进行分类。也就是说，获取分子的、生理的形态的、血清学的或生态来源等多层次信息来对微生物分类和鉴别。虽然使用仪器进行鉴定的方式越来越普及，但不建议放弃初筛步骤，如形态观察、染色镜检、重要的生化反应，因为鉴定通常需要根据所有可用信息来证实。例如，伤寒沙门菌不太可能从洁净室中分离出来，但这种病原体可能存在于动物源性成分中。
微生物鉴定通常需要考虑的点如表所示：
调查方面 | 考虑点 |
仪器和数据 | 鉴别用仪器是否被良好维护并经过校准;试剂是否通过了质量控制检查与数据库匹配的概率是否足够高，或者需要补充测试结果的微小变化导致的完全不同的识别吗;分离物是否需要进一步的培养才能获得完整的表型表达分离物是否难以通过所采用的鉴定技术与其他相关种属区分，例如芽孢杆菌属 |
微生物组织的特征 | 在生产设施、公用工程、药物成分或制剂产品中曾经分离到该菌属微生物特征和生理需求使得微生物可能在生产设施、公用设施、药物成分和(或制剂产品中持续存在微生物可能从人员或设施所在的地理位置或气候区的设施中分离出来微生物与罕见疾病有关吗，是否苛刻的增长要求使其不太可能被鉴别 |
对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行适当的鉴定，掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。实际工作中无菌试验阳性结果中分离出的微生物，经对其溯源分析，确认污染归因于无菌试验过程中所使用的材料或无菌技术的差错，该试验可判无效，否则判该产品不符合要求。
如下表为PDA期刊“Points to Consider for Aseptic Processing Part 1 January2015”中的举例，给出了
微生物鉴定的程度。
程度 | 分离和来源 |
仅进行表型鉴定(革兰染色和形态检查) | C级和D级环境监测中，超警戒限 |
采用表型法鉴定到属(可能到种) | C级和D级环境监测中，超行动限 |
采用表型法鉴定到种 | A/B 级区，辅料、成品、环境监测样品、水系统超警戒限和行动限的分离菌 |
菌株分型或分子指纹图谱(基因方法) | 重大产品污染事故(如培养基模拟滥装或无菌检查尖败)、环境和水系统监挖中重大不良趋势 |
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